蛋白和配體結(jié)合的強(qiáng)弱不同，對(duì)于蛋白檢測(cè)以及親和分離純化實(shí)驗(yàn)有顯著影響。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮這種結(jié)合強(qiáng)弱影響，以便采用合適的蛋白或配體濃度（包括zui低檢測(cè)限濃度），估算結(jié)合時(shí)間，獲得最佳并且實(shí)用的結(jié)果。 這對(duì)于室溫下易失去活性，或希望盡可能保持最高活性蛋白的純化尤為重要。

常規(guī)的蛋白檢測(cè)方法，比如ELISA，只能測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的蛋白結(jié)合數(shù)值，不能跟蹤整個(gè)過(guò)程。這不利于獲取結(jié)合的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，阻礙了實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化。自從上個(gè)世紀(jì)90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技術(shù)后，目前已有幾種生物傳感器技術(shù)，能夠跟蹤蛋白和配基的real-time結(jié)合過(guò)程，檢測(cè)結(jié)合的全部過(guò)程，給出結(jié)合的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。下圖是我在SRU Biosystems用光學(xué)生物傳感測(cè)定蛋白A和不同濃度人類IgG隨時(shí)間變化的結(jié)合曲線。IgG濃度在100μg/mL時(shí)，結(jié)合在2-3分鐘內(nèi)迅速上升后，緩慢增加。在濃度減小時(shí)，結(jié)合速度變慢。濃度在6.25μg/mL時(shí)，結(jié)合在180分鐘內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地增加。濃度小于1μg/mL時(shí)，結(jié)合仍然進(jìn)行，但是十分緩慢。

絕大多數(shù)生化實(shí)驗(yàn)室，沒(méi)有real-time跟蹤檢測(cè)手段，蛋白檢測(cè)或者純化過(guò)程中，確定蛋白的濃度和結(jié)合時(shí)間通常根據(jù)結(jié)合的強(qiáng)弱來(lái)確定，而結(jié)合強(qiáng)弱是通過(guò)解離常數(shù)來(lái)判斷的。

在化學(xué)、生物化學(xué)中，解離常數(shù)（K_D) 是一種反應(yīng)的平衡常數(shù)，用于測(cè)量較大物體可逆地分離（解離）成較小成分的傾向。解離常數(shù)是結(jié)合常數(shù)的倒數(shù)。 雖然解離常數(shù)是動(dòng)力學(xué)理論的參數(shù)， 但是它在生物化學(xué)，尤其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上有現(xiàn)實(shí)意義的指導(dǎo)作用。

鏈霉親和素（streptavidin）是生物化學(xué)常用的試劑。它于生物素（biotin）結(jié)合的K_D非常小，僅為~10^?14M。 強(qiáng)度與共價(jià)鍵類似。前文介紹過(guò)，鏈霉親和素是非常穩(wěn)定50K_D蛋白，經(jīng)常用來(lái)與熒光、紅外、ELISA標(biāo)記等化學(xué)結(jié)合而不失去其生物活性。生物素是分子量244，帶有羧基的小分子。 容易與蛋白化學(xué)結(jié)合。這樣帶有標(biāo)記的鏈霉親和素，與帶有生物素的蛋白結(jié)合，從而避免直接標(biāo)記蛋白。鏈霉親和素和生物素K_D小。對(duì)比于直接標(biāo)記二抗的方法，采用標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素的方法用量小、時(shí)間短，達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。基于這種原因，標(biāo)記的鏈霉親和素、化學(xué)活化的生物素以及生物素結(jié)合的二抗等蛋白檢測(cè)試劑，比較容易購(gòu)買，這對(duì)于實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)非常便利。